14次 摘要：本研究通過體外生化實驗研究細胞色素P450 3A7對維生素D3的羥化作用。根據GenBank報道的序列設計特異引物,擴增cyp3a7的編碼區,將cyp3a7的編碼區插入到pcDNATM3.1/myc-His(-) A的XhoⅠ/Bam HⅠ,通過測序檢測序列的正確性。pcDNA-CYP3A7及pcDNA分別瞬時轉 --> 摘要：本研究通過體外生化實驗研究細胞色素P450 3A7對維生素D3的羥化作用。根據GenBank報道的序列設計特異引物,擴增cyp3a7的編碼區,將cyp3a7的編碼區插入到pcDNATM3.1/myc-His(-) A的XhoⅠ/Bam HⅠ,通過測序檢測序列的正確性。pcDNA-CYP3A7及pcDNA分別瞬時轉染293T細胞,48 h后收集細胞,提取S9組分,用Bradford法測定蛋白質濃度。S9組分經12%SDS-PAGE凝膠電泳和Western blotting檢測,用myc抗體作為一抗檢測CYP3A7在293T細胞的表達水平。0.6 mg S9組分與1μmol/L維生素D3于37℃孵育30 min,用4倍體積的氯仿甲醇(體積比為3∶1)抽提,有機相在氮氣流下吹干,殘基用于HPLC分析。結果顯示,重組表達CYP3A7的293T細胞的S9組分通過Western blotting檢測到了特異的約60 kD的條帶,對照樣品未檢測到特異條帶的蛋白質。重組表達CYP3A7的293T細胞S9組分的孵育樣品通過HPLC檢測到了25-羥基維生素D3,對照樣品未檢測到25-羥基維生素D3。結果表明重組表達的CYP3A7羥化維生素D3生成25-羥基維生素D3。本研究為進一步探究還有哪些P450參與維生素D3在雞體內的代謝,為闡明其代謝途徑提供理論依據。 關鍵詞：雞; 細胞色素P450; 代謝; 維生素D3; 維生素D3除了經典的調節礦物質代謝和內環境穩態以外，還在腎外組織及細胞發揮重要的生物功能：調節靶細胞的增值、分化或功能，與腫瘤發生、免疫調節、抗炎效應等相關(Haussler et al.,2013;Deluca,2014;Adams et al.,2014)。維生素D3是影響蛋殼質量、硬度的重要因素，補充維生素D3有利于蛋殼質量提高，因此，維生素D3是影響雌雞產蛋的重要因素(Kottferováet al.,2001)。維生素D3對禽類骨骼生長有重要影響，據報道高水平的維生素D3促進火雞骨生長和骨骼礦化，因此，維生素D3對禽類產蛋和骨骼生長具有重要影響(Kim et al.,2011)。 首先，維生素D3與維生素D3結合蛋白(DBP)結合，轉運到肝臟，被細胞色素P450羥化為初具生物活性的25-hydroxyvitamin D3(25(OH)D3),25(OH)D3是維生素D3的主要循環形式，臨床上應用25(OH)D3反映體內維生素D營養狀態(Gupta et al.,2004)。25(OH)D3被轉運到腎臟，被1α羥化酶轉化為1α，25(OH)2D3，后者是體內最強生物活性維生素D3，因此也稱為活性維生素D3。在人體內維生素D3的代謝途徑及其代謝酶已經研究的較為深入，多個細胞色素P450可以在維生素D3的C-25羥化維生素D3生成25(OH)2D3，參與此反應的細胞色素P450主要包括CYP3A4、CYP2R1等(Chen et al.,2003;Gupta et al.,2004)。 然而，禽類代謝維生素D3的P450未見報道。因此，探究維生素D3在雞體內的羥化過程具有重要意義。據報道人的CYP3A4羥化維生素D3生成25(OH)D3，雞CYP3A7也是雞體內源及外源化合物代謝的關鍵羥化酶，序列比對分析表明雞CYP3A7與人CYP3A4相似度最高。推測CYP3A7可能是參與VD3的代謝。本研究擬以雞CYP3A7為研究對象，明確CYP3A7是否可以羥化維生素D3。 1結果與分析 1.1 cyp3a7克隆及真核表達載體構建 用KOD FX和引物(F1,R1)從一月齡青腳麻雞cDNA(實驗室保存)擴增cyp3a7編碼區，PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離，獲得約1 500 bp條帶(圖1)，與GenBank報道的1 527 bp相符合。目的條帶切膠回收純化，將pMD18-T載體與PCR產物的連接，連接產物熱激轉化E.coli DH5α感受態，利用菌落PCR篩克隆，陽性克隆共5個(圖2)。隨機挑選兩個陽性克隆提質粒和測序，序列正確的質粒保存備用，命名為pMD-CYP3A7。 以質粒pMD-CYP3A7為模板，用KOD FX和引物(F2,R2)擴增基因cyp3a7編碼區，PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離純化回收(圖3A)。將pcDNA和CYP3A7雙酶切產物純化回收、連接，連接產物熱激轉化E.coli DH5α感受態細胞，利用菌液PCR篩克隆(圖3B)。篩選到5個陽性克隆，隨機選擇兩個提質粒、測序。經測序鑒定擴增的片段去掉了基因3'的TGA，融合載體的表達標簽myc-his，以利于檢測。構建的哺乳動物真核表達質粒命名為pcDNA-CYP3A7。 1.2 Western blotting檢測重組CYP3A7融合蛋白在293T細胞的表達 分別收集pcDNA-CYP3A7和空載體pcDNA瞬時轉染293T細胞后，制備S9組分，用1μg、2.5μg、5μg S9組分經12%SDS-PAGE分離，轉印到PVDF膜。表達載體pcDNA-CYP3A7在CYP3A7的3'融合Myc-His標簽，Myc抗體檢測比較特異，所以用Myc抗體做一抗檢測CYP3A7的表達。重組蛋白質樣品經Western blotting實驗檢測到約60 k D大小特異條帶，與重組CYP3A7的大小相符合，并且當上樣量倍增時條帶亮度也隨之增大。CYP3A7的編碼區蛋白質為58.248 kD，末端融合載體的myc-his標簽，其核酸序列為GGATCCGAGCTCGGTACCAAGCT TGGGCCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGG ATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATC ATCATTGA，翻譯為氨基酸序列則為GSELGTKLG PEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH,3.452 kD，融合表達的CYP3A7共61.7 kD。而對照樣品未檢測到條帶。結果表明重組CYP3A7在293T細胞成功表達(圖4)。 圖1 cyp3a7 PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳 Figure 1 1%w/v agarose gel electrophoresis of PCR products for cyp3a7 注:M:DNA MarkerⅢ;箭頭:cyp3a7的PCR產物 圖2 cyp3a7菌液PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳 Figure 2 1%w/v agarose gel electrophoresis of bacteria liquid PCR products for cyp3a7 注:M:DNA MarkerⅢ;1～14:cyp3a7的菌液PCR產物 圖3 cyp3a7 PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳 Figure 3 1%w/v agarose gel electrophoresis of PCR products for cyp3a7 注:M:DNA MarkerⅢ;箭頭:cyp3a7的PCR產物;1～15:cyp3a7的菌液PCR產物 1.3酶活實驗 pcDNA-CYP3A7和空載體pcDNA瞬時轉染293T細胞，將制備的樣品用于HPLC檢測(圖5)。標準品用的濃度比較高，用了10μmol/L的D3和25(OH)D3，分析標準品D3的色譜峰(圖5A)，在12.9 min檢測到一個特異的底物峰，分析標準品25(OH)D3的色譜峰(圖5B)，出峰時間是5.9 min。用1μmol/L D3與pcDNA-CYP3A7瞬時轉染293T細胞的S9組分孵育的樣品(圖5C)，底物D3和羥化產物25(OH)D3被探測到；1μmol/L維生素D3與pcDNA瞬時轉染293T細胞的S9組分孵育的樣品(圖5D)，僅12.9 min檢測到底物D3，未在5.9 min檢測到羥化產物25(OH)D3。結果表明CYP3A7能催化維生素D3在C-25位單加氧生成25(OH)D3。 圖4 CYP3A7在293T細胞表達的Western blotting檢測 Figure 4 The expression of CYP3A7 in 293T cells was confirmed by Western blotting 注:M:蛋白質Marker;1～3:pc DNA-cyp3a7轉染293T細胞的S9組分1μg,2.5μg,5μg;4:pc DNA-CYP3A7轉染293T細胞制備的S9組分5μg 2討論 細胞色素P450是一個酶系，包括2種細胞色素(細胞色素P450,細胞色素b5)和2種黃素蛋白(NADPH-細胞色素P450還原酶,NAD-細胞色素b5還原酶)以及磷脂，其中起中心作用的是細胞色素P450及細胞色素P450還原酶。最早細胞色素P450酶被認為僅存在于動物，現在普遍認為細胞色素P450酶廣泛存在于細菌、真菌、植物和動物體內(劉文波等,2016)。植物細胞色素P450酶是一類膜結合的亞鐵血紅素單加氧酶，催化羥基化、環氧化、脫氫、異構化、C—C鍵的裂解及脫鹵、脫氨與雜原子氧化等反應。在植物生長、發育、天然產物的合成與異源物質的降解中發揮不同的作用(陳雷等,2014;程麗等,2017)。對于哺乳動物而言，細胞色素P450主要存在于肝臟，研究比較多的是CYP1、CYP2、CYP3家族，在內源性(如脂肪酸,類固醇,前列腺素,膽汁酸等)和外源性物質(臨床藥物,環境污染物等)的代謝過程中，起到重要作用(劉文波等,2016)。 Ourlin等(2000)首次克隆到雞CYP3A7(NM＿00-1001751.2)，曾用基因名為CYP3A37，其m RNA全長1 637 bp，編碼508個氨基酸，高度保守，與人CYP3A4相似度高達69.7%，是CYP3A家族非常重要的細胞色素P450成員。Ourlin等(2000)利用17α策略構建CYP3A7的原核表達載體，簡而言之，將雞3A7的信號肽去掉，N端融合牛CYP17α信號肽，C端融合His標簽。將重組表達的融合蛋白的編碼區插入到pSE380表達載體的多克隆位點。利用溶解的膜與底物孵育研究CYP3A7的催化活性，研究結果表明重組表達雞CYP3A7羥化CYP3A家族的特征底物睪丸酮和孕酮。Yuan等(2013)將雞CYP3A7也利用17α策略構建CYP3A7原核表達載體，將CYP3A7的N端信號肽去掉，N端N端融合牛CYP17α信號肽，將重組表達的融合蛋白的編碼區插入到pCWori+。利用溶解的膜研究CYP3A7的催化功能，體外生化實驗結果表明重組表達的CYP3A7能羥化T-2毒素生成3'OH T-2毒素。以上結果顯示，CYP3A7是雞體內重要的羥化酶。 圖5 293T-CYP3A7代謝D3所產生的25(OH)D3的HPLC檢測 Figure 5 HPLC assay of D3metabolized to 25(OH)D3by 293T-CYP3A7 注:A:標準品維生素D3;B:標準品25(OH)D3;C:1μmol/L維生素D3與pc DNA-CYP3A7瞬時轉染的293T細胞S9組分孵育的樣品,25(OH)D3被探測到;D:1μmol/L維生素D3與pc DNA瞬時轉染293T細胞S9組分孵育的樣品,25(OH)D3未被探測到 以上2個報道均用了重組CYP3A7在大腸桿菌中原核表達，用溶解的大腸桿菌膜做體外生化孵育實驗。本實驗用真核體系表達CYP3A7，用293T細胞做表達宿主，因為293T是常用的表達外源基因的宿主細胞。本實驗采用S9組分做實驗，因為S9組分是應用合適的緩沖液勻漿組織或細胞后通過離心而獲得的上清液(9 000 g,15 min)，包含細胞質和微粒體，易于獲得，因此，常被用于測定藥物及其他外源化合物的代謝分析(Zhu et al.,2017)。維生素D3及其羥化產物的檢測方法常用HPLC和液質檢測。現在，很多研究采用HPLC檢測，本研究也用HPLC檢測代謝產物和底物，與Yasuda等(2013)的檢測方法相似。 研究報道日糧中添加25(OH)D3比添加維生素D3效果明顯。日糧中添加500 IU/kg的25(OH)D3可顯著提高肉雞腎臟1α-羥化酶和十二指腸m VDR mRNA表達水平，改善肉雞生長性能和骨骼礦化(張金龍等,2017)。給1～21 d齡的火雞飼料中補充25(OH)D3(69μg/kg)可提高免疫力，促進生長(Vazquez et al.,2018)。飼料中添加25(OH)D3比維生素D3效果明顯，25(OH)D3對促進火雞生長和骨礦物質代謝的生物效應是維生素D3的2倍多(Han et al.,2016)。所以，研究維生素D3在雞體內的關鍵羥化酶以及代謝途徑具有重要意義。 本實驗構建了真核表達載體pcDNA-CYP3A7，瞬時轉染293T細胞，在293T細胞表達成功。提取的S9組分與底物維生素D3孵育，HPLC方法檢測到了產物，而對照樣品中未檢測到產物。表明了CYP3A7羥化維生素D3生成25(OH)D3(圖6)。 本實驗室也擴增雞的CYP2R1，但是沒有擴增出來，可能是由于其mRNA含量較少。還有哪些P450參與維生素D3在雞體內的羥化反應還有待深入研究。本研究將進一步深入研究其他P450參與維生素D3在雞體內的代謝的成員，并闡明其代謝途徑。 圖6 CYP3A7羥化D3生成25(OH)D3 Figure 6 D3was hydroxylated to 25(OH)D3by CYP3A7 3材料與方法 3.1實驗材料 載體pcDNATM3.1/myc-His(-)A、雞肝cDNA和293T細胞由陜西理工大學生工學院動物生理實驗室保存；低質量分子標準免疫蛋白Marker購自于北京全式金生物技術公司；DNA MarkerⅢ購自于鼎國北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；KOD FX高保真DNA聚合酶購自于東洋紡(上海)生物科技有限公司；限制性內切酶XhoⅠ和Bam HⅠ、DNA A-Tailing Kit和pMD18-T Vector購自于寶生物工程大連有限公司；myc羊抗小鼠抗體和HRP標記的山羊抗小鼠Ig G購自于碧云天生物技術有限公司；色譜甲醇、維生素D3和25(OH)D3購自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純購自國藥集團。DMEM高糖培養基、血清、雙抗(鏈霉素,青霉素)購自于賽默飛世爾(中國)。 3.2基因克隆 根據GenBank報道的CYP3A7的序列(Gene ID:414832)，設計引物(F1:ATGAACTTTCTTCCTTT CTTCTCC和R1:CTATGCCTTGGCAGTGTTGGTC)。用KOD FX從青腳麻雞肝cDNA擴增CYP3A7的ORF,58℃退火，所得的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目的條帶。用DNA A-Tailing Kit在3'加A，按照說明書配反應液72℃反應20 min。pMD18-T載體與加了A尾的PCR產物連接(16℃,60 min)。連接產物熱激轉化E.coli DH5α感受態，37℃生長16 h后，菌液PCR篩選陽性轉化子，將陽性轉化子提質粒，英濰捷基公司用pMD18-T載體通用引物測序。 3.3表達載體構建 設計特異性引物(F2:CCGCTCGAGATGAACTT TCTTCCTTTCTTCTCC和R2:CGCGGATCCTGCC TTGGCAGTGTTGGTC,下劃線標注限制性內切酶堿基)，在編碼區的5'和3'分別引入XhoⅠ和Bam HⅠ限制性內切酶酶切位點，并去掉CYP3A7編碼區TGA，在cyp3a7的3'融合載體的myc-His標簽，利用pcDNATM3.1/myc-His(-)A的終止子終止翻譯。以上述構建pMD-CYP3A7為模板，用KOD FX高保真酶擴增cyp3a7的編碼區，58℃退火，其他步驟參見說明書。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收目的條帶。用XhoⅠ和Bam HⅠ限制性內切酶雙酶切PCR產物和pcDNATM3.1/myc-His(-)A載體6 h,DNA純化試劑盒回收酶切產物。將回收的cyp3a7和載體的雙酶切產物連接過夜，轉化E.coli DH5α感受態，37℃生長16 h后，菌液PCR篩選陽性轉化子，將陽性轉化子進行DNA測序，保存序列正確的的質粒。 3.4 293T細胞培養 復蘇293T細胞，在DMEM培養基完全培養基培養(含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素)。培養條件：37℃，5%CO2。 3.5 293T細胞瞬時轉染 293T細胞接種于10 cm平皿，過夜，鋪板率達到70%左右，pcDNA-CYP3A7和空載體pcDNA分別轉染293T細胞。轉染試劑用GenEscortTMⅠ(PEI)購自于上海起發實驗試劑有限公司，詳細操作步驟參見GenEscortTMⅠ的說明書。簡而言之，8μg質粒和24μL PEI分別加入到500μL DMEM無血清培養基中混勻后靜置5 min，將含PEI的DMEM加入到含質粒的DMEM中混勻后靜置15 min，吸干平皿的培養基，然后將質粒PEI復合物加入到10 cm平皿中，補加1 m L完全培養基，4 h后補加8 mL完全培養基培養48 h后，收集細胞。 3.6 Western blotting pcDNA-CYP3A7和空載體pcDNA轉染后48 h，分別收集細胞，用PBS懸浮，超聲破碎，用Bradford方法測定蛋白濃度。在1μg蛋白質樣品中加入等體積的2×Loading Buffer混勻，煮沸失活，樣品用SDS-PAGE分離。80 V，冰上轉膜2 h。5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，TBST洗膜3次，每次5 min;myc小鼠抗體稀釋1 000倍，4℃孵育過夜，洗膜3次，每次5 min;HRP標記的山羊抗小鼠Ig G稀釋1 000倍，室溫孵育2 h，洗膜3次，每次5 min。用BeyoECL Plus超敏發光液顯色2 min，暗盒曝光2 min，顯影2 min，定影15 min。 3.7酶活實驗 轉染后培養48 h的293T細胞收集，提取S9組分，詳細步驟參見參考文獻(Shang et al.,2013)。簡而言之，用緩沖液2 mL 100 mmol/L Tris-HCl(pH值7.4)洗培養皿2次，在冰上用細胞刮刮下細胞，離心(4℃,300 g,3 min)，用緩沖液重懸，冰上超聲破碎(10%功率,工作2 s,暫停9 s工作10次)，轉移到新的離心管離心(4℃,9 000 g,15 min)，上清即為S9組分轉移到新的離心管備用，用Bradford方法測定蛋白濃度。0.6 mg S9組分用于孵育實驗，孵育反應的體系：500μL孵育總體積，1μmol/L D3，緩沖液為100 mmol/L Tris-HCl(pH值7.4),MgCl2終濃度15 mmol/L。在37℃預孵育5 min，加入NADPH終濃度為1 mmol/L起始反應，37℃反應30 min，加入4倍體積的抽提液(體積比為3∶1的氯仿和甲醇)終止反應，渦旋振蕩2 min,3 000 r/min室溫離心10 min。有機相轉移到干凈的棕色玻璃瓶中，在氮氣流下吹干，200μL甲醇溶解，0.45μmol/L濾膜過濾，10μL用于HPLC檢測。安捷倫1200(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)，色譜柱Hypersil BDS C18(大連依利特分析儀器有限公司,4.6 mmol/L×250 mmol/L,5μmol/L),1 mL/min,265 nm，流動相A是水，流動相B是甲醇，0～10 min,85%～100%B梯度洗脫；10～18 min 100%B等度洗脫，柱溫40℃。 參考文獻 []Adams J.S.,Rafison B.,Witzel S.,Rachel E.,Reyes R.E.,Shieh A.,Chun R.,Zavala K.,Hewison M.,and Liu P.T.,2014,Regulation of the extrarenal CYP27B1-hydroxylase,J.Steroid Biochem.Mol.,144:22-27 []Chen J.B.,Motol D.L.,Mangelsdorf 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